Si presentano le risultanze di uno studio che ha caratterizzato la carne proveniente da animali di razza bovina piemontese allevati con agricoltura eco-simbiotica

1. CNR-IBBA
Vincenzo Longo
Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria
CNR, Pisa
Email: v.longo@ibba.cnr.it
PROPRIETA’ NUTRACEUTICHE DI CARNE BOVINA DA
AGRICOLTURA SIMBIOTICA
1

2. 2
Uno degli obiettivi dell’Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria
Sede Secondaria di Pisa-CNR è
valorizzare alimenti di qualità ottenuti con tecniche sostenibili ed
innovative focalizzando l’attenzione sulle proprietà nutraceutiche
CNR-IBBA

3. L’agricoltura eco-simbiotica si basa
sul principio che per migliorare le
tecniche produttive una delle
possibilità più innovative da
esplorare è il ricorso all’utilizzo di
microrganismi come biostimolanti
delle piante.
Sui terreni coltivati viene rispettata
la turnazione e non sono utilizzati
fertilizzanti chimici, pesticidi né
antibiotici ma funghi arbuscolari
micorrizici.
3

4. L’obiettivo del nostro lavoro:
caratterizzare la carne proveniente da animali
di razza bovina piemontese allevati
con agricoltura eco-simbiotica.
Parte I:
Caratterizzazione
biochimica e stabilità
ossidativa
Parte II:
Digestione in vitro e
isolamento dei peptidi
bioattivi della carne
4

5. 5

6. Proteine Lipidi Minerali
Ferro Zinco Fosforo Magnesio Calcio Potassio
(g/100g) (mg/kg)
23,6±0,55 1,12±0,12 10,4±1,3 26,0±1,3 0,70±0,03 203 ± 3,4 138 ± 2,1 2611±52,8
Media±DS (n=6) del contenuto totale di proteine e lipidi misurati con metodo di Lowry e di Folch ed espressi
come g su 100g di carne e del contenuto di ferro e zinco, magnesio, calcio, potassio e fosforo misurati
mediante spettrometria d’assorbimento atomico ed espressi come mg/Kg di carne.
6

7. g/100g di acidi grassi totali
C14:0 1,93±0,17 C17:1 0,82±0,14
C14:1 0,48±0,06 C18:0 13,23±0,20
C15:0 0,26±0,03 C18:1n-9 37,28±1,65
C16:0 20,85±0,49 C18:1n-7 2,76±0,11
C16:1 3,09±0,23 C18:2n-6 9,71±1,13
C16:2 0,56±0,04 C18:3n-3 0,61±0,06
C17:0 1,10±0,18 CLA 0,42±0,05
C16:3 0,67±0,08 C20:4n-6 2,50±0,55
Media±DS (n=6) degli acidi grassi nel muscolo semimembranoso della
fesa mediante gas cromatografia.
7

8. Glutatione Perossidazione
lipidica
Carbonilazione
proteica
Catalasi Glutatione
perossidasi
Superossido
dismutasi
(μg GSH/g) (nmol MDA
eq/g)
(nmol NPH/g) (μmol/g x
min)
(μmol/g x min) (U/g)
109,2±18,1 1,97±0,06 166,13±13,24 153,5±9,1 0,93±0,08 156,9±8,4
Media±DS (n=6) del contenuto di glutatione (saggio di Ellman), la perossidazione lipidica (TBARS) , la carbonilazione
proteica (DNPH) e l’ attività degli enzimi: catalasi, glutatione perossidasi e superossido dismutasi misurati con saggi
spettrofotometrici.
8

9. ➢ Misura la capacità di un campione di
inibire l’ossidazione delle LDL.
➢ Questo processo determina la formazione
di dieni coniugati che assorbono a 240
nm.
➢ I risultati vengono confrontati con un
controllo negativo, le LDL, e uno positivo,
la Vitamina C.
Risultati riportati come profilo cinetico dei dieni
coniugati (A) e come lag time ossia il tempo
necessario all’ossidazione delle LDL (B). **=p<0,01
vs LDL; ***=p<0,001 vs LDL.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 5000 10000 15000 20000
ConjugateDienes
Time (Sec)
LDL
Vit C (0,5) µg/ml
La granda
A
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
LDL ECO Vit C 0,5 μg/ml
LagTime(sec)
**
***
La granda
B
9

10. ZEA α-ZOL β-ZOL
(ng/g) (ng/g) (ng/g)
ND 4,6±0,79 ND
Risultati della HPLC-UV detector espressi come media± DS (n=3) di ng/g di carne.
Lo Zearalenone (ZEA) è una
micotossina prodotta principalmente
dai funghi delle specie Fusarium che si
sviluppano soprattutto nelle colture
cerealicole. Lo ZEA e i suoi metaboliti
α-Zol, β-Zol, α-Zal e β-Zal, si legano
ai recettori per gli estrogeni favorendo
la sintesi dell’RNA, di proteine e la
proliferazione cellulare.
10

11. Glutatione Perossidazione lipidica
Carbonilazione proteica
Media±DS (n=6) nella carne fresca, congelata
sottovuoto e non sottovuoto.***=p<0,001;
**=p<0,01; *=p<0,05 vs carne fresca.
0
20
40
60
80
100
120
140
fresca congelata sv congelata non sv
μgGSH/g
***
11

12. Media±DS (n=6) nella carne fresca, congelata
sottovuoto e non sottovuoto. ***=p<0,001;
**=p<0,01; *=p<0,05 vs fresca.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
fresca congelata sv congelata non sv
μmol/gxmin
*
*
Catalasi
12

13. La carne bovina proveniente dagli allevamenti che utilizzano
l’agricoltura eco-simbiotica presenta:
➢buon contenuto di minerali e acidi grassi mono e polinsaturi;
➢azione inibitoria sul processo di ossidazione delle LDL;
➢livelli minimi di contaminazione da α-ZOL e nessuno di ZEA e β-ZOL;
➢elevata stabilità ossidativa sia nel prodotto fresco che congelato
sottovuoto in quanto non si osservano variazioni nel contenuto di
glutatione, nella carbonilazione proteica e nella attività di due enzimi
antiossidanti, la superossido dismutasi e la glutatione perossidasi.
13

14. 14

15.  Sequenze di 2-40 amminoacidi, inattivi nelle proteine native, funzionali in seguito a
digestione in vivo, idrolisi enzimatica in vitro o fermentazione.
 Studi recenti ne hanno dimostrato l’attività antiossidante (Rajapakse et al., 2005), anti-
infiammatoria, anti-ipertensiva, anti-diabetica, anti-batterica etc..(Lafarga et al., 2014).
 Tali attività dipendono soprattutto dalla sequenza amminoacidica.
 Principali fonti: latte, legumi ed estratti proteici muscolari di carne e pesce.
15

16. ➢ Omogenizzazione della fesa cruda;
➢ Estrazione delle proteine sarcoplasmatiche e miofibrillari;
➢ Dosaggio delle proteine con metodo di Lowry;
➢ Digestione:
Step orale (α-amilasi,10’, 37°C)
Step gastrico (Pepsina in ambiente acido, 2h, 37°C)
Step duodenale (Pancreatina+ Bile in ambiente basico, 2h, 37°C)
16

17. Pre-Dig PS Idrolisato PS PS<30KDa 3<PS<30KDa PS<3KDa
μmoli TE/
mg proteine
μmoli TE/
mg proteine
μmoli TE/
mg proteine
μmoli TE/
mg proteine
μmoli TE/
mg proteine
0,06±0,01 0,23±0,01** 0,36±0,04** 0,11±0,03* 0,29±0,03**
Pre-Dig PM Idrolisato PM PM<30KDa 3<PM<30KDa PM<3KDa
μmoli TE/
mg proteine
μmoli TE/
mg proteine
μmoli TE/
mg proteine
μmoli TE
/mg proteine
μmoli TE/
mg proteine
0,07±0,01 0,22±0,04** 0,40±0,09*** 0,14±0,01** 1,38±0,05***###
Risultati del test ABTS come media±DS (n=6) nelle proteine sarcoplasmatiche (PS) e miofibrillari (PM)
espressi come μmoli Trolox Equivalenti/mg di proteine. *=p<0,05; **=p<0,01; ***=p<0,001 vs Pre-Dig.
#=p<0,005 vs Idrolisato.
17

18. 0,00E+00
5,00E+02
1,00E+03
1,50E+03
2,00E+03
2,50E+03
3,00E+03
3,50E+03
4,00E+03
Pre-Dig PS Idrolisato PS PS<30 3 > PS < 30 PS< 3
μmoliTE/mgproteine
***
##
***
0,00E+00
5,00E+02
1,00E+03
1,50E+03
2,00E+03
2,50E+03
3,00E+03
Pre-Dig PM Idrolisato PM PM<30 3 > PM< 30 PM< 3
μmoliTE/mgproteine
***
##***
Risultati del test ORAC. Media±DS (n=6) nelle
proteine sarcoplasmatiche (PS) e miofibrillari
(PM) espressi come μmoli TE/mg di proteine.
***=p<0,005; ***=p<0,001 vs Pre-Dig PM.
##=p<0,01 vs Idrolisato.
18

19. 0
20
40
60
80
100
120
%ACE-inibizione
***
0
20
40
60
80
100
120
%ACE-inibizione
#
***
Media±DS della % di inibizione dell’enzima ACE nelle proteine sarcoplasmatiche (PS) e miofibrillari
(PM). ***=p<0,001 vs Pre-Dig. #=p<0,05 vs Idrolisato.
19

20. IC50 Pre-Dig PS Idrolisato PS PS<30KDa 3<PS<30KDa PS<3KDa
mg
proteine/ml
mg
proteine/ml
mg
proteine/ml
mg
proteine/ml
mg proteine/ml
ND 0,19±0,02*** 0,19±0,01*** 0,38±0,02*** 0,15±0,01***
IC50 Pre-Dig PM Idrolisato PM PM<30KDa 3<PM<30KDa PM<3KDa
mg
proteine/ml
mg
proteine/ml
mg
proteine/ml
mg
proteine/ml
mg proteine/ml
ND 0,20±0,01*** 0,14±0,02*** 0,35±0,06*** 0,11±0,01*** #
Media±DS dell’IC50 dell’enzima ACE nelle proteine sarcoplasmatiche (PS) e miofibrillari (PM). ***=p<0,001
vs Pre-Dig. #=p<0,05 vs Idrolisato.
20

21. 0
20
40
60
80
100
120
E. coli E. aerogenes S. typhimurium E. faecalis S. aureus
Crescitabatterica(%)
CNT
Pre-Dig PS
Idrolisato PS
3<PS<30
PS<30
Ps< 3
**
**
**
** **
***
###
***
###
***
###
***
###
***
###
Media±DS (n=6) della % di crescita batterica, nelle proteine sarcoplasmatiche. **=p<0,01;
***=p<0,001 vs Pre-Dig PS. ###=p<0,005 vs Idrolisato PS.
21

22. 0
20
40
60
80
100
120
E. coli E. aerogenes S. typhimurium E. faecalis S. aureus
Crescitabatterica(%)
CNT
Pre-Dig PM
Idrolisato PM
3<PM<30
PM<30
Pm< 3
***
###
***
###
***
###
**
**
***
***
**
**
**
Media±DS (n=6) della % di crescita batterica, nelle miofibrillari. **=p<0,01;
***=p<0,001 vs Pre-Dig PM. ###=p<0,005 vs Idrolisato PM.
***
###
***
###
22

23. 0
20
40
60
80
100
120
EDTA
0,1mg/ml
EDTA
0,2mg/ml
EDTA
0,5mg/lm
EDTA
1mg/ml
Pre-Dig
PS
Idrolisato
PS
PS<30 3 > PS <
30
PS< 3
AttivitàFe2+chelante(%)
***
#*
Media±DS (n=6) nelle proteine sarcoplasmatiche. #=p<0,05;
***=p<0,001 vs Pre-Dig PS. #=p<0,05 vs Idrolisato PS.
23

24. Media±DS (n=6) nelle proteine miofibrillari. #=p<0,05;
***=p<0,001 vs Pre-Dig PM. ##=p<0,01 vs Idrolisato PM.
0
20
40
60
80
100
120
EDTA
0,1mg/ml
EDTA
0,2mg/ml
EDTA
0,5mg/lm
EDTA
1mg/ml
Pre-Dig
PM
Idrolisato
PM
PM<30 3 > PM <
30
PM< 3
AttivitàFe2+chelante(%)
***
##
*
24

25.  Nell’ambito delle ricerche sui peptidi della carne, questo lavoro
rappresenta una novità per la fonte primaria, rappresentata dalle
proteine miofibrillari e sarcoplasmatiche della fesa di bovino
piemontese. Inoltre, è stato messo a punto il processo di digestione in
vitro ed è stato selezionato il grado d’idrolisi ottimale per le attività.
 I risultati hanno messo in luce un aumento del potenziale
antiossidante delle frazioni proteiche dopo la digestione rispetto ai
campioni non digeriti.
 Dopo la digestione in vitro, i campioni proteici hanno mostrato potere
anti-ipertensivo, antibatterico e Fe2+-chelante.
 I migliori risultati sono stati riscontrati nei peptidi delle proteine
miofibrillari con peso molecolare minore di 3KDa, in accordo con dati
presenti in letteratura che mostrano un maggior potenziale biologico
di peptidi con peso molecolare compreso tra 500 e 1000 Da.
25

26. I peptidi bioattivi, composti che stanno acquisendo sempre più
consensi e approvazione in ambito sperimentale e terapeutico.
26
Siamo all’inizio… necessitano ulteriori studi

27. 27
Ringraziamenti
Dr.ssa Della Croce
Dr.ssa Russo
Dr.ssa Pucci
Dr.ssa Frassinetti
Dr. Ciardi
Sig. Caltavuturo
Dr. Valter Lubrano (Fondazione Monasterio)

28. 28